GCSH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-406784-ACT-2

O gene humano GCSH codifica a proteína H do sistema de clivagem da glicina, uma subunidade mitocondrial carreadora de lipoíla que transporta intermediários entre os componentes P, T e L do complexo da glicina descarboxilase, sustentando o catabolismo da glicina e a transferência de unidades de um carbono. Por meio de sua atividade dependente de lipoylação, a GCSH contribui para o metabolismo mitocondrial de um carbono mediado por folatos, influenciando a biossíntese de nucleotídeos, o equilíbrio redox e o acoplamento metabólico com a interconversão serina–glicina. A disrupção genética de GCSH ou a lipoylação prejudicada está ligada a defeitos na via de clivagem da glicina e tem sido associada a erros inatos do metabolismo, como a hiperglicinemia não cetótica. A edição genômica de GCSH possibilita estudos mecanísticos do metabolismo mitocondrial de aminoácidos, da lipoylação de proteínas e do fluxo de um carbono, incluindo a geração de modelos celulares para investigar respostas ao estresse metabólico e a função de variantes.

GCSH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GCSH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCSH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GCSH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GCSH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCSH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GCSH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCSH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCSH em células tumorais com expressão de GCSH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.