Plasmide CRISPR d'Activation (h2) GCSH: sc-406784-ACT-2

Le gène humain GCSH code la protéine H du système de clivage de la glycine, une sous-unité mitochondriale porteuse de lipoate qui assure la navette des intermédiaires entre les composants P, T et L du complexe glycine décarboxylase afin de soutenir le catabolisme de la glycine et le transfert d’unités monocarbonées. Grâce à une activité dépendante de sa lipoylation, GCSH contribue au métabolisme monocarboné mitochondrial médié par les folates, avec des répercussions sur la biosynthèse des nucléotides, l’équilibre rédox et le couplage métabolique avec l’interconversion sérine–glycine. Des altérations génétiques de GCSH ou une lipoylation déficiente sont liées à des dysfonctionnements de la voie de clivage de la glycine et ont été associées à des erreurs innées du métabolisme telles que l’hyperglycinémie non cétosique. L’édition du génome ciblant GCSH permet des études mécanistiques du métabolisme mitochondrial des acides aminés, de la lipoylation des protéines et des flux monocarbonés, notamment par la génération de modèles cellulaires pour analyser les réponses au stress métabolique et la fonction de variants.

GCSH Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GCSH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCSH Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GCSH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GCSH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCSH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GCSH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCSH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCSH dans les cellules tumorales présentant une expression de GCSH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.