Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCN1L1: sc-411545-ACT

Le gène humain GCN1 (GCN1L1) code un cofacteur associé au ribosome qui relie le stress traductionnel à la réponse intégrée au stress en facilitant l’activation de la kinase eIF2α GCN2 lors d’une limitation en acides aminés et d’autres stress nutritionnels apparentés. Par ce rôle, GCN1L1 contribue à coordonner l’atténuation globale de la traduction avec des programmes de traduction sélectifs qui soutiennent la protéostasie et l’adaptation métabolique. La perturbation de la signalisation de stress régulée par GCN1L1 peut influencer les réponses transcriptionnelles dépendantes d’ATF4, l’autophagie et les décisions de survie cellulaire en conditions protéotoxiques ou de privation de nutriments. Le dérèglement de ces voies a été impliqué dans des contextes tels que la tolérance des cellules tumorales au stress, les défauts de protéostasie associés aux maladies neurodégénératives et des mécanismes de maladies métaboliques, ce qui fait de GCN1L1 un nœud utile pour des études ciblées sur les voies de signalisation.

GCN1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GCN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCN1L1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GCN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GCN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCN1L1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GCN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCN1L1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCN1L1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GCN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.