GCN1L1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411545-ACT

Human GCN1 (GCN1L1) kodiert einen ribosomenassoziierten Kofaktor, der translationalen Stress mit der integrierten Stressantwort koppelt, indem er bei Aminosäuremangel und verwandten Nährstoffstressbedingungen die Aktivierung der eIF2α-Kinase GCN2 erleichtert. In dieser Funktion hilft GCN1L1, die globale Dämpfung der Translation mit selektiven Translationsprogrammen zu koordinieren, die Proteostase und metabolische Anpassung unterstützen. Eine Störung der von GCN1L1 regulierten Stresssignalgebung kann ATF4-abhängige Transkriptionsantworten, Autophagie und zelluläre Überlebensentscheidungen unter proteotoxischen oder nährstoffarmen Bedingungen beeinflussen. Eine Fehlregulation dieser Signalwege wurde in Zusammenhängen wie der Stresstoleranz von Tumorzellen, proteostasebezogenen Defekten bei Neurodegeneration und Mechanismen metabolischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, was GCN1L1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für pathway-fokussierte Studien macht.

GCN1L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCN1L1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCN1L1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCN1L1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCN1L1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.