GCC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411304-ACT

Human GCC2 (GRIP- und Coiled-Coil-Domäne enthaltend 2) kodiert ein peripheres Golgi-Protein, das am trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert ist und dort an Vesikel-Tethering und Membrantransportprozessen beteiligt ist, die für die Sortierung von Fracht und die Aufrechterhaltung der Golgi-Architektur wichtig sind. Über Interaktionen mit durch kleine GTPasen regulierter Transportmaschinerie trägt GCC2 zur Dynamik des Endosom–Golgi-Transports bei, die die Proteinverarbeitung und Sekretion mitprägt. Störungen von Golgi-Tethering- und Transportwegen sind breit relevant für die zelluläre Homöostase, einschließlich Stressantworten, Polarität und regulierter Sekretionsprogramme. Veränderte Expression oder Funktion Golgi-assoziierter Coiled-Coil-Tether wie GCC2 wurde im Kontext von Erkrankungen untersucht, bei denen Membrantransport und Sekretion fehlreguliert sind, darunter Krebs sowie neurodegenerationsbezogene Prozesse.

GCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.