Plásmido CRISPR de Activación (h) GALE: sc-408127-ACT

La GALE humana (UDP-galactosa-4-epimerasa) cataliza la interconversión reversible de UDP-galactosa y UDP-glucosa, así como de UDP-N-acetilgalactosamina y UDP-N-acetilglucosamina, conectando la vía de Leloir con un metabolismo más amplio de azúcares nucleotídicos. A través de estas actividades, GALE ayuda a mantener la homeostasis de los carbohidratos y suministra azúcares activados necesarios para procesos de glicosilación que determinan el plegamiento proteico, el tráfico intracelular y la señalización célula–célula. La alteración del flujo dependiente de GALE puede modificar la composición de los glicanos y afectar programas biosintéticos asociados con el RE y el aparato de Golgi. La disfunción de GALE se asocia con la galactosemia por deficiencia de epimerasa y es relevante para estudios de respuestas al estrés metabólico y de fenotipos ligados a la glicosilación.

GALE El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GALE sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GALE El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GALE en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GALE, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GALE. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GALE y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GALE en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GALE en células tumorales con expresión de GALE silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.