Plasmide CRISPR d'Activation (h) GALE: sc-408127-ACT

La GALE humaine (UDP-galactose-4-épimérase) catalyse l’interconversion réversible de l’UDP-galactose et de l’UDP-glucose, ainsi que de l’UDP-N-acétylgalactosamine et de l’UDP-N-acétylglucosamine, reliant la voie de Leloir au métabolisme plus large des sucres nucléotidiques. Par ces activités, la GALE contribue au maintien de l’homéostasie glucidique et fournit des sucres activés nécessaires aux processus de glycosylation qui modèlent le repliement des protéines, leur trafic et la signalisation cellule–cellule. Une perturbation du flux dépendant de la GALE peut modifier la composition des glycanes et affecter les programmes biosynthétiques associés au RE et à l’appareil de Golgi. Un dysfonctionnement de la GALE est associé à la galactosémie par déficit en épimérase et est pertinent pour les études des réponses au stress métabolique et des phénotypes liés à la glycosylation.

GALE Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GALE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GALE Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GALE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GALE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GALE. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GALE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GALE au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GALE dans les cellules tumorales présentant une expression de GALE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.