GAD-65 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402137-ACT

GAD2 codifica la glutammato decarbossilasi 65 (GAD-65), un enzima dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza la decarbossilazione del glutammato in acido γ-aminobutirrico (GABA), uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale umano. La GAD-65 è arricchita nelle terminazioni presinaptiche, dove sostiene la sintesi di GABA dipendente dall’attività e contribuisce al ciclo delle vescicole sinaptiche e all’omeostasi dei circuiti inibitori. Regolando l’equilibrio tra eccitazione e inibizione, GAD2 influenza le reti di segnalazione neuronale coinvolte nel neurosviluppo, nella plasticità sinaptica e nei circuiti responsivi allo stress. Alterazioni dell’espressione o della funzione di GAD-65 sono state studiate in relazione a fenotipi neurologici e neuropsichiatrici associati a una trasmissione GABAergica compromessa, inclusa la suscettibilità alle crisi convulsive e la disfunzione degli interneuroni inibitori.

GAD-65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GAD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GAD-65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GAD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GAD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GAD-65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GAD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GAD-65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GAD-65 nelle cellule tumorali con espressione di GAD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.