GAD-65 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402137-ACT

GAD2 codifica a glutamato descarboxilase 65 (GAD-65), uma enzima dependente de fosfato de piridoxal que catalisa a descarboxilação do glutamato para ácido gama-aminobutírico (GABA), um dos principais neurotransmissores inibitórios do sistema nervoso central humano. A GAD-65 é enriquecida em terminais pré-sinápticos, onde sustenta a síntese de GABA dependente da atividade e contribui para a ciclagem de vesículas sinápticas e para a homeostase de circuitos inibitórios. Ao regular o equilíbrio entre excitação e inibição, GAD2 influencia redes de sinalização neuronal envolvidas no neurodesenvolvimento, na plasticidade sináptica e em circuitos responsivos ao estresse. Alterações na expressão ou na função da GAD-65 têm sido investigadas no contexto de fenótipos neurológicos e neuropsiquiátricos associados à neurotransmissão GABAérgica desregulada, incluindo susceptibilidade a crises convulsivas e disfunção de interneurônios inibitórios.

GAD-65 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GAD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GAD-65 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GAD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GAD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GAD-65. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GAD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GAD-65 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GAD-65 em células tumorais com expressão de GAD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.