Plasmide CRISPR d'Activation (h) GABARAP: sc-416746-ACT

GABARAP (GABA type A receptor-associated protein) est un membre de la famille ATG8, apparenté à l’ubiquitine, qui régule l’autophagie en favorisant la maturation des autophagosomes, le recrutement des cargos et la fusion avec les lysosomes via des interactions avec des protéines contenant un motif d’interaction avec LC3 (LIR). Il contribue également au trafic membranaire intracellulaire et au regroupement des récepteurs, reliant le flux autophagique au transport vésiculaire et à l’organisation du cytosquelette. La dérégulation des voies associées à GABARAP est pertinente dans les déséquilibres de la protéostase, les processus neurodégénératifs et l’adaptation des cellules cancéreuses au stress, où une autophagie altérée peut influencer les signaux de survie et le remodelage métabolique. En tant que petite protéine d’échafaudage possédant de nombreux partenaires de liaison, GABARAP est fréquemment étudiée pour disséquer les mécanismes d’autophagie sélective et le contrôle qualité des organites.

GABARAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GABARAP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GABARAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GABARAP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GABARAP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GABARAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GABARAP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GABARAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GABARAP dans les cellules tumorales présentant une expression de GABARAP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.