GABA T-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403545-ACT

SLC6A11 kodiert den menschlichen GABA-Transporter 3 (GAT-3), einen Na⁺/Cl⁻-abhängigen Membrantransporter, der γ-Aminobuttersäure (GABA) aus dem extrazellulären Raum entfernt und die inhibitorische Neurotransmission mitprägt. Durch die Regulation der synaptischen und extrasynaptischen GABA-Verfügbarkeit beeinflusst GAT-3 die Chlorid-Homöostase, die neuronale Erregbarkeit und Netzwerkoszillationen und ist funktionell mit dem GABA-Shunt gekoppelt, der den Neurotransmitterkreislauf mit dem zellulären Stoffwechsel verbindet. Die SLC6A11-Aktivität ist in astrozytär-neuronale Stoffwechselinteraktionen und Transportprozesse eingebunden, die die Neurotransmitter-Wiederaufnahme und synaptische Signalübertragung feinabstimmen. Eine dysregulierte GABA-Aufnahme und eine veränderte SLC6A11-Expression wurden im Zusammenhang mit neuropsychiatrischen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen untersucht, bei denen das Gleichgewicht inhibitorischer Schaltkreise gestört ist.

GABA T-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC6A11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GABA T-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC6A11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC6A11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GABA T-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC6A11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GABA T-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GABA T-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC6A11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.