GABA T-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403545-ACT

SLC6A11 codifica per il trasportatore umano del GABA 3 (GAT-3), un trasportatore di membrana Na⁺/Cl⁻-dipendente che rimuove l’acido γ-aminobutirrico (GABA) dallo spazio extracellulare e modella la neurotrasmissione inibitoria. Regolando la disponibilità di GABA sinaptico ed extrasinaptico, GAT-3 influenza l’omeostasi del cloruro, l’eccitabilità neuronale e le oscillazioni di rete, e si accoppia funzionalmente allo shunt del GABA che collega il riciclo del neurotrasmettitore al metabolismo cellulare. L’attività di SLC6A11 è integrata con le interazioni metaboliche astrocita–neurone e con processi di trasporto che modulano la ricaptazione dei neurotrasmettitori e la segnalazione sinaptica. Una ricaptazione del GABA disregolata e un’alterata espressione di SLC6A11 sono state studiate nel contesto di fenotipi neuropsichiatrici e del neurosviluppo in cui l’equilibrio dei circuiti inibitori risulta perturbato.

GABA T-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC6A11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GABA T-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC6A11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC6A11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GABA T-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC6A11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GABA T-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GABA T-3 nelle cellule tumorali con espressione di SLC6A11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.