G6PD CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420446-ACT

Das murine Gen **G6pdx** kodiert die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD), das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des oxidativen Zweigs des Pentosephosphatwegs, das Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton umsetzt und dabei NADPH erzeugt. NADPH unterstützt glutathionabhängige antioxidative Abwehrmechanismen, die Redox-Homöostase sowie biosynthetische Programme einschließlich der Lipid- und Nukleotidsynthese und beeinflusst damit Proliferation und zelluläre Stressantworten. Die G6PD-Aktivität überschneidet sich mit metabolischer Umprogrammierung bei der Immunaktivierung und der Pufferung mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies, wodurch sie mit Signalwegen verknüpft ist, die Entzündung, die Anfälligkeit für Ferroptose und die Proteostase regulieren. Veränderte G6PD-Expression oder -Aktivität wird широко als Modell zur Untersuchung oxidativstressbezogener Phänotypen und metabolischer Verwundbarkeiten genutzt, die für anemiaähnliche Redoxdefekte sowie kardiometabolische und neuroinflammatorische Kontexte relevant sind.

G6PD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen G6pdx-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G6PD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des G6pdx-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der G6pdx-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G6PD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native G6pdx-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G6PD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G6PD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem G6pdx-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.