FRY CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404629-ACT

Das humane FRY kodiert ein großes, evolutionär konserviertes, mikrotubuliassoziiertes Protein, das an der Organisation des Zytoskeletts, der Zellpolarität und der Kontrolle der Proliferation beteiligt ist. FRY wurde mit Hippo-verwandten Signalwegen und Kinase-Netzwerken in Verbindung gebracht, die Centrosomen- und Mikrotubuli-Dynamik mit der Zellzyklusprogression und der Morphogenese koppeln. Vor diesem Hintergrund wird FRY in Zusammenhängen wie epithelialer Organisation, neuronaler Entwicklung und Migration untersucht, in denen Störungen der zytoskelettalen Regulation onkogene Phänotypen beeinflussen können. Eine veränderte FRY-Expression oder -Funktion wurde in mehreren krankheitsrelevanten Datensätzen berichtet, was seine Eignung als Forschungsziel zur Aufklärung von Signalwegen unterstützt, die Wachstumskontrolle und Gewebearchitektur steuern.

FRY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FRY-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FRY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FRY-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FRY-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FRY-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FRY-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FRY-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FRY-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FRY-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.