follistatin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401687-ACT

L’FST umano codifica la follistatina, una glicoproteina secreta che si lega ai ligandi della superfamiglia TGF-β e li neutralizza, in particolare le activine e diverse BMP, modulando così i programmi trascrizionali dipendenti da SMAD2/3 e SMAD1/5/8. Regolando la disponibilità dei ligandi, la follistatina influenza la crescita e la differenziazione cellulare, il rimodellamento tissutale e il crosstalk infiammatorio in molteplici contesti, tra cui il muscolo scheletrico, i tessuti riproduttivi e il microambiente tumorale. Una deregolazione dell’espressione di FST è stata associata ad alterazioni della miogenesi e della segnalazione correlata alla fibrosi, a perturbazioni dell’asse riproduttivo e a fenotipi rilevanti per il cancro legati a uno squilibrio delle vie activina/BMP. In quanto “guardiano” della via, la follistatina è spesso utilizzata per studiare la dinamica della rete TGF-β e gli effetti della segnalazione paracrina in modelli cellulari ingegnerizzati.

follistatin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

follistatin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di follistatin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da follistatin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via follistatin nelle cellule tumorali con espressione di FST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.