FANCA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403205-ACT

FANCA kodiert eine zentrale Komponente des Fanconi-Anämie(FA)-DNA-Reparaturwegs, der die Reparatur von DNA-Interstrang-Crosslinks koordiniert und während der S-Phase Replikationsgabeln stabilisiert. FANCA ist Teil des FA-Core-Komplexes, der die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI fördert und dadurch die nachgeschaltete nukleolytische Prozessierung sowie eine mit homologer Rekombination assoziierte Reparatur ermöglicht. Eine Störung von FANCA beeinträchtigt die Genomintegrität, erhöht die Chromosomenbrüchigkeit und macht Zellen empfindlicher gegenüber Crosslinking-Schäden; damit ist dieses Gen sowohl mit der molekularen Pathologie der Fanconi-Anämie als auch mit umfassenderen Mechanismen von Replikationsstress verknüpft. Entsprechend wird FANCA häufig in Signalwegen untersucht, die DNA-Schadenssignalisierung, Zellzyklus-Checkpoints und die Aufrechterhaltung der chromosomalen Stabilität steuern.

FANCA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FANCA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FANCA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FANCA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FANCA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FANCA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FANCA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FANCA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FANCA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FANCA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.