Ero1-Lα Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424456-ACT

O gene Ero1l do mouse codifica a oxidoredutina 1 alfa do RE (Ero1-Lα), uma flavoproteína do retículo endoplasmático que reoxida as isomerases de dissulfeto de proteínas para sustentar a formação de ligações dissulfeto durante o dobramento oxidativo de proteínas. Ao acoplar a oxidação de tióis à transferência de elétrons dependente de FAD, a Ero1-Lα contribui para a homeostase redox do RE e se conecta à resposta a proteínas mal dobradas (UPR), à degradação associada ao RE (ERAD) e à proteostase da via secretória. Alterações na atividade da Ero1-Lα podem modificar o estresse oxidativo e a sinalização de estresse de cálcio/RE, vinculando a regulação de Ero1l a contextos como adaptação à hipóxia, inflamação e demandas secretórias associadas a tumores. Essas propriedades tornam Ero1l um alvo útil para estudar a maturação controlada por redox de proteínas secretadas e de membrana e a remodelação da função do RE em resposta ao estresse.

Ero1-Lα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ero1l sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ero1-Lα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ero1l em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ero1l, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ero1-Lα. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ero1l nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ero1-Lα no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ero1-Lα em células tumorais com expressão de Ero1l silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.