ERdj4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410882-ACT

Die humane DNAJB9-Genregion kodiert ERdj4, einen lumenalen Hsp40/DnaJ-Co-Chaperon des endoplasmatischen Retikulums (ER), der die Qualitätskontrolle der Proteinfaltung unterstützt, indem er die ATPase-Aktivität von BiP/GRP78 stimuliert. ERdj4 wird bei ER-Stress induziert und trägt zu Programmen der Unfolded-Protein-Response (UPR) bei, indem es chaperonvermittelte Faltung mit dem ER-assoziierten Abbau (ERAD) koppelt, um Proteotoxizität zu begrenzen. Über diese Funktionen hilft DNAJB9, die Proteostase, die Homöostase des sekretorischen Weges sowie stressadaptive transkriptionelle Netzwerke zu regulieren. Eine dysregulierte ER-Proteostase und UPR-Signalübertragung unter Beteiligung von ERdj4 wurde in Forschungszusammenhängen mit Entzündung, metabolischer Dysfunktion und Proteinfehlfaltungs-Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration und die Krebsbiologie relevant sind.

ERdj4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNAJB9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ERdj4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNAJB9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNAJB9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ERdj4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNAJB9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ERdj4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ERdj4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNAJB9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.