ENT2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401952-ACT

ヒトのSLC29A2は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2（ENT2）をコードしており、細胞膜を介したプリンおよびピリミジンヌクレオシドのNa+非依存的な移動を促進する、双方向性の形質膜トランスポーターである。ENT2は、ヌクレオシドのサルベージ経路、細胞内ヌクレオチドプール、ならびに細胞外アデノシンの取り扱いの調節に関与し、膜輸送をDNA/RNA合成、エネルギー代謝、プリン作動性シグナル伝達と結び付ける。ヌクレオチド生合成の基質利用可能性や薬剤の取り込み／排出に影響することから、ENT2は、モデル系における増殖制御、代謝ストレス応答、ならびにヌクレオシドアナログに対する感受性の研究に関連する。ヌクレオシド輸送およびプリン恒常性の変化は、炎症、虚血関連シグナル、腫瘍生物学などの病態生理学的状況に関与することが示唆されており、輸送に起因する表現型を解析するためのENT2に焦点を当てたツールの利用を支持している。

ENT2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性SLC29A2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

ENT2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における SLC29A2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSLC29A2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性ENT2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSLC29A2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるENT2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSLC29A2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるENT2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。