EDG-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402448-ACT

LPAR2 (EDG-4) kodiert einen G‑Protein-gekoppelten Rezeptor für Lysophosphatidsäure, der vorwiegend an Gi/Gq-Signale gekoppelt ist und dadurch Second-Messenger-Signalwege reguliert, die den Umbau des Zytoskeletts, den Calciumfluss und transkriptionelle Programme steuern. Die Aktivierung des Rezeptors beeinflusst die Rho/ROCK-, PLC/PKC-, PI3K–AKT- und MAPK-Signalübertragung und verknüpft so extrazelluläre Lipidsignale mit Zellmigration, Überleben und Entzündungsreaktionen. In humanen Zellen trägt die LPAR2-Aktivität zur kontextabhängigen Regulation des Verhaltens von Epithel- und Immunzellen bei und wird häufig in Modellen für Fibrose, metabolische Dysfunktion und Signalgebung im tumorassoziierten Mikromilieu untersucht. Eine dysregulierte LPAR2/EDG-4-Signalgebung wurde mit aberranten Proliferations- und Motilitätsphänotypen in Verbindung gebracht und ist daher für die Analyse von Signalwegen in krankheitsrelevanten Zellsystemen von Bedeutung.

EDG-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LPAR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EDG-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LPAR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LPAR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EDG-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LPAR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EDG-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EDG-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LPAR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.