Plásmido CRISPR de Activación (m) dystrophin: sc-420021-ACT

Dmd codifica la distrofina, una gran proteína citoesquelética que conecta la red de actina con el complejo distrofina–glicoproteínas en el sarcolema, proporcionando estabilidad a la membrana durante la contracción muscular. En el músculo esquelético y cardíaco de ratón, la distrofina contribuye a la mecanotransducción, la organización de los costámeros y el mantenimiento de la homeostasis del calcio, con efectos posteriores sobre las vías de inflamación y remodelado fibrótico cuando su expresión se reduce. La alteración o disminución de la función de la distrofina se asocia con daño progresivo de las miofibras y una integridad muscular comprometida, lo que convierte a Dmd en un gen central para estudiar fenotipos de degeneración muscular. Los procesos dependientes de Dmd también son relevantes para modelar cambios en la señalización de la matriz extracelular, las respuestas al estrés y los programas transcripcionales de los mionúcleos en contextos de enfermedades neuromusculares.

dystrophin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Dmd sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

dystrophin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Dmd en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Dmd, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de dystrophin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Dmd y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de dystrophin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía dystrophin en células tumorales con expresión de Dmd silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.