Plasmide CRISPR d'Activation (h) DPYD: sc-403396-ACT

Le gène humain **DPYD** code la dihydropyrimidine déshydrogénase, une flavoprotéine cytosolique qui catalyse l’étape limitante de la réduction de l’uracile et de la thymine, initiant ainsi le catabolisme des pyrimidines. En contrôlant le renouvellement des pyrimidines, DPYD influence l’homéostasie des nucléotides, l’équilibre des précurseurs de l’ARN/ADN et les réponses cellulaires au stress métabolique. Une activité DPYD altérée a été associée à des erreurs innées du métabolisme des pyrimidines et à une variabilité dans la prise en charge des fluoropyrimidines, reliant cette voie à des contextes de recherche en neurodéveloppement et en pharmacogénomique. DPYD constitue donc un nœud d’intérêt pour étudier la régulation métabolique, la biochimie redox et les effets, à l’échelle des voies, sur la prolifération et la viabilité cellulaire.

DPYD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DPYD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DPYD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DPYD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DPYD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DPYD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DPYD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DPYD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DPYD dans les cellules tumorales présentant une expression de DPYD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.