Plásmido CRISPR de Activación (h) DLST: sc-409604-ACT

DLST (dihidrolipoamida S-succiniltransferasa) codifica el componente central E2 del complejo mitocondrial 2-oxoglutarato deshidrogenasa, un nodo enzimático clave del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Al catalizar la formación de succinil-CoA a partir de α-cetoglutarato y coordinar la transferencia de acilos dependiente de lipoato, DLST sostiene el metabolismo oxidativo, la producción de NADH y el equilibrio redox mitocondrial. La función de DLST conecta el metabolismo central del carbono con el catabolismo de aminoácidos y con una homeostasis mitocondrial más amplia, procesos que se estudian con frecuencia en contextos de estrés metabólico y disfunción mitocondrial. La regulación alterada de componentes del ciclo TCA, incluido DLST, se ha asociado en la literatura con la remodelación bioenergética observada en la biología de enfermedades neurodegenerativas y proliferativas, lo que respalda su relevancia para la investigación mecanística.

DLST El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DLST sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DLST El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DLST en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DLST, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DLST. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DLST y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DLST en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DLST en células tumorales con expresión de DLST silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.