DLD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403207-ACT

O DLD humano codifica a dihidrolipoamida desidrogenase, uma oxidorredutase dependente de FAD que atua como a subunidade E3 compartilhada pelos complexos piruvato desidrogenase, α-cetoglutarato desidrogenase e desidrogenase de α-cetoácidos de cadeia ramificada nas mitocôndrias. Ao reoxidar a dihidrolipoamida e transferir elétrons para o NAD+, o DLD ajuda a sustentar a produção de acetil-CoA, o fluxo do ciclo do TCA e o equilíbrio redox mitocondrial. Essa atividade conecta o catabolismo de carboidratos e aminoácidos à fosforilação oxidativa e ao controle de espécies reativas de oxigênio. Alterações na função do DLD estão associadas à disfunção metabólica mitocondrial e a fenótipos de doenças neurometabólicas, tornando-o um nó relevante para estudos de homeostase energética e sinalização dependente de redox.

DLD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DLD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DLD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DLD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DLD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DLD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DLD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DLD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DLD em células tumorais com expressão de DLD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.