Plasmide Double Nickase (h) DHFR: sc-416991-NIC

Le gène humain **DHFR2** code la dihydrofolate réductase (DHFR), une enzyme dépendante du NADPH qui catalyse la réduction du dihydrofolate en tétrahydrofolate, assurant ainsi le métabolisme à un carbone nécessaire à la biosynthèse *de novo* du thymidylate et des purines. Par son rôle dans le cycle des folates, la DHFR soutient la réplication et la réparation de l’ADN, la progression du cycle cellulaire et la capacité de méthylation cellulaire via son lien avec le métabolisme de la méthionine/S-adénosylméthionine. Une perturbation de l’activité de la DHFR influence l’équilibre des réserves de nucléotides et la stabilité du génome, des processus souvent étudiés dans des contextes de stress prolifératif et de remodelage métabolique. La biologie de la DHFR est donc largement mise à profit pour étudier les voies biosynthétiques dépendantes des folates et les réponses cellulaires à la déplétion en nucléotides et au stress de réplication.

DHFRL1 Le plasmide double nickase (h) se compose d'une paire de plasmides appariés, conçus pour une édition hautement spécifique du locus DHFR2 dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide exprime une nickase Cas9 D10A et un sgRNA distinct ciblant des brins d'ADN opposés au sein de DHFR2. Lorsqu'elles sont dirigées vers des sites adjacents sur des brins d'ADN opposés, les deux nickases génèrent des cassures simple brin décalées qui, ensemble, produisent une cassure double brin décalée, nécessitant une activité coordonnée sur la cible de la part des deux guides. La cassure d'ADN qui en résulte est résolue par les voies de réparation cellulaires endogènes, le plus souvent par jonction non homologue (NHEJ), ce qui conduit à des insertions ou des délétions qui perturbent la fonction de DHFR2. En nécessitant l'engagement de deux ARNsg au locus cible, l'approche par double nick améliore la spécificité de l'édition et offre une stratégie CRISPR complémentaire pour les applications où un contrôle supplémentaire de la précision du ciblage est souhaité.

Afin de faciliter l'identification efficace des cellules éditées, un plasmide code pour la GFP permettant la visualisation par fluorescence des populations transfectées, tandis que le plasmide compagnon porte un gène de résistance à la puromycine pour la sélection antibiotique. Ensemble, ces caractéristiques favorisent l'enrichissement efficace des populations co-transfectées et simplifient la validation des clones présentant une perturbation de DHFR2.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.