DDX60 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433350-ACT

Das Mausgen **Ddx60** kodiert **DDX60**, eine durch Interferon induzierbare DExD/H-Box-RNA-Helikase, die als zytosolischer Sensor und Regulator der antiviralen angeborenen Immunität fungiert. DDX60 ist an der RNA-Metabolisierung und an Mustererkennungswegen beteiligt, indem es die RIG-I/MDA5-abhängige Signalübertragung fördert, Typ-I-Interferonantworten verstärkt und ISG-Expressionsprogramme unterstützt, die die Virusreplikation einschränken. Über Interaktionen mit RNA-Substraten und Komponenten der Immun-Signalgebung beeinflusst DDX60 NF-κB- und IRF-gesteuerte transkriptionelle Netzwerke und prägt zelluläre Antworten auf Stress durch doppelsträngige RNA. Eine Fehlregulation der Ddx60-Aktivität ist daher relevant für Untersuchungen zu inflammatorischer Signalgebung, Wirt–Pathogen-Interaktionen und immunassoziierten Krankheitsmechanismen in Mausmodellen.

DDX60 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ddx60-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DDX60 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ddx60-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ddx60-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DDX60-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ddx60-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DDX60-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DDX60-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ddx60-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.