DDIT3/CHOP/GADD153 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400051-ACT

DDIT3, também conhecido como CHOP/GADD153, codifica um fator de transcrição bZIP induzível por estresse que integra sinais da resposta a proteínas mal enoveladas (unfolded protein response, UPR) e da resposta integrada ao estresse. É fortemente induzido a jusante do eixo PERK–eIF2α–ATF4 durante o estresse do retículo endoplasmático e modula programas transcricionais que controlam apoptose, autofagia, equilíbrio redox e regulação do ciclo celular. O DDIT3 influencia desfechos adaptativos versus terminais do estresse ao alterar a expressão de genes envolvidos no enovelamento proteico, no metabolismo de aminoácidos e na função mitocondrial. A desregulação da sinalização de DDIT3 tem sido associada à sobrevivência de células cancerosas sob estresse proteotóxico, a fenótipos de estresse metabólico e neurodegenerativo e a eventos de fusão oncogênica, como FUS–DDIT3 no lipossarcoma mixoide.

DDIT3/CHOP/GADD153 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDIT3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DDIT3/CHOP/GADD153 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDIT3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDIT3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DDIT3/CHOP/GADD153. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDIT3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DDIT3/CHOP/GADD153 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DDIT3/CHOP/GADD153 em células tumorais com expressão de DDIT3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.