cytochrome c1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404958-ACT

O CYC1 humano codifica o citocromo c1, uma subunidade central do complexo III da cadeia respiratória mitocondrial (ubiquinol–citocromo c redutase), que medeia a transferência de eletrões do ubiquinol para o citocromo c e dá suporte à translocação de protões através da membrana interna da mitocôndria. Pelo seu papel na fosforilação oxidativa, o citocromo c1 contribui para a produção de ATP, a manutenção do potencial de membrana mitocondrial e a homeostase redox, com efeitos a jusante na sinalização por espécies reativas de oxigénio e na adaptação metabólica. Alterações na função do complexo III e desequilíbrios bioenergéticos mitocondriais estão frequentemente associados a fenótipos neuromusculares e metabólicos e foram observados em contextos de metabolismo do cancro e noutras perturbações caracterizadas por disfunção mitocondrial. Assim, a expressão de CYC1 e a integridade do complexo III são amplamente estudadas como indicadores da regulação da cadeia de transporte de eletrões, das respostas ao stress mitocondrial e da remodelação bioenergética.

cytochrome c1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CYC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cytochrome c1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CYC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CYC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cytochrome c1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CYC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cytochrome c1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cytochrome c1 em células tumorais com expressão de CYC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.