Cystinosin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405040-ACT

CTNS kodiert Cystinosin, einen Transporter in der lysosomalen Membran, der den Export von Cystin aus dem lysosomalen Lumen in das Zytosol vermittelt und damit das intrazelluläre Redoxgleichgewicht sowie die Aminosäure-Homöostase unterstützt. Durch die Regulation der lysosomalen Cystin-Clearance verknüpft Cystinosin die Lysosomenfunktion mit übergeordneten Stoffwechselprozessen, darunter die Autophagie-Lysosomen-Dynamik und zelluläre Stressantworten. Eine veränderte CTNS-Aktivität stört die lysosomale Speicherung und nachgeschaltete Proteostase-Wege, wodurch CTNS zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der Organellen-Qualitätskontrolle und metabolischer Anpassung wird. CTNS ist mit der cystinosebedingten lysosomalen Dysfunktion assoziiert und wird häufig in Modellen der Physiologie des proximalen Nierentubulus sowie des systemischen Aminosäuretransports untersucht.

Cystinosin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTNS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cystinosin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTNS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTNS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cystinosin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTNS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cystinosin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cystinosin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTNS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.