CYPOR CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422345-ACT

Das murine Por-Gen kodiert die Cytochrom-P450-Oxidoreduktase (CYPOR), ein flavinhaltiges ER-Membranprotein, das Elektronen von NADPH auf mikrosomale Cytochrom-P450-Enzyme und andere Redox-Partner überträgt. Durch die Ermöglichung der katalytischen P450-Zyklen unterstützt CYPOR den oxidativen Stoffwechsel endogener Lipide und Steroide sowie die Biotransformation von Xenobiotika und verknüpft die Por-Aktivität mit der hepatischen Entgiftung, der Redox-Homöostase und ER-assoziierten metabolischen Netzwerken. Eine veränderte CYPOR-Funktion stört P450-abhängige Signal- und Stoffwechselwege und kann das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies verschieben, wodurch Por zu einer wichtigen Variablen in Modellen von metabolischem Stress und pharmakologiebezogenen Phänotypen wird. In der biomedizinischen Forschung wird Por häufig untersucht, um die Anforderungen an den Elektronentransfer von P450-Enzymen von substratspezifischen Effekten zu trennen und Genotyp-zu-Metabolit‑Beziehungen über verschiedene Gewebe hinweg zu kartieren.

CYPOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Por-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYPOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Por-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Por-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYPOR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Por-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYPOR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYPOR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Por-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.