CYPOR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422345-ACT

Il gene Por del topo codifica la citocromo P450 ossidoreduttasi (CYPOR), una flavoproteina di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che trasferisce elettroni dal NADPH agli enzimi del citocromo P450 microsomiale e ad altri partner redox. Rendendo possibili i cicli catalitici dei P450, CYPOR sostiene il metabolismo ossidativo di lipidi e steroidi endogeni, oltre alla biotrasformazione di xenobiotici, collegando l’attività di Por alla detossificazione epatica, all’omeostasi redox e alle reti metaboliche associate al RE. Un’alterazione della funzione di CYPOR perturba le vie dipendenti dai P450 e può modificare l’equilibrio delle specie reattive dell’ossigeno, rendendo Por una variabile chiave nei modelli di stress metabolico e nei fenotipi legati alla farmacologia. Nella ricerca biomedica, Por viene comunemente studiato per distinguere i requisiti di trasferimento elettronico dei P450 dagli effetti specifici del substrato e per mappare le relazioni tra genotipo e metaboliti nei diversi tessuti.

CYPOR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Por senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYPOR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Por nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Por, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYPOR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Por nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYPOR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYPOR nelle cellule tumorali con espressione di Por silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.