CPI-17 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401966-ACT

O gene humano PPP1R14A codifica a CPI-17, um inibidor dependente de fosforilação da fosfatase da cadeia leve de miosina (MLCP) que intensifica a contração do músculo liso ao manter a fosforilação da cadeia leve regulatória de miosina. Após a ativação por quinases como PKC e ROCK, a CPI-17 conecta a sinalização de receptores acoplados à proteína G à sensibilização ao Ca²⁺, integrando vias que controlam a dinâmica do citoesqueleto, a contratilidade celular e a motilidade. Esse nó regulatório é amplamente relevante para a fisiologia do músculo liso vascular e das vias aéreas e para mecanismos de remodelamento actomiosínico em células não musculares. A sinalização desregulada de PPP1R14A/CPI-17 tem sido investigada em contextos envolvendo tônus contrátil e remodelamento anormais, incluindo a biologia de doenças cardiovasculares e pulmonares.

CPI-17 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R14A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CPI-17 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R14A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R14A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CPI-17. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R14A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CPI-17 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CPI-17 em células tumorais com expressão de PPP1R14A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.