Chr-A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400405-ACT

CHGA codifica la cromogranina A (Chr-A), una proteina dei granuli secretori arricchita nelle cellule neuroendocrine che supporta la biogenesi delle vescicole a nucleo denso, l’immagazzinamento degli ormoni peptidici e l’esocitosi regolata. La processazione proteolitica di Chr-A genera peptidi bioattivi che modulano la secrezione neuroendocrina, la segnalazione vascolare e metabolica e le vie di risposta allo stress. L’espressione di CHGA correla con la differenziazione neuroendocrina e con l’attività della via secretoria, rendendolo un marcatore utile e un nodo funzionale per studi sulla segnalazione endocrina, sul traffico vescicolare e sulle reti di processazione dei peptidi. Livelli e pattern di processazione di CHGA/Chr-A deregolati sono associati a fenotipi neuroendocrini e alla biologia di malattie legate alla secrezione, a supporto della sua rilevanza nella ricerca orientata ai biomarcatori e ai meccanismi.

Chr-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHGA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Chr-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHGA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHGA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Chr-A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHGA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Chr-A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Chr-A nelle cellule tumorali con espressione di CHGA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.