chordin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404997-ACT

Das humane CHRD kodiert Chordin, ein sezerniertes, cysteinreiches Glykoprotein, das die BMP-Signalübertragung antagonisiert, indem es BMP-Liganden im extrazellulären Raum bindet und deren Interaktion mit Rezeptoren begrenzt. Durch die Formung der Aktivität des BMP/TGF-β-Signalwegs trägt Chordin zur Regulation der embryonalen Musterbildung, der mesodermalen Spezifizierung und der Gewebemorphogenese bei, mit nachgeschalteten Effekten auf SMAD-vermittelte Transkriptionsprogramme. Eine fehlregulierte CHRD-Expression oder eine veränderte BMP-Antagonisierung wurde mit Entwicklungsanomalien und krankheitsassoziierten Umbauprozessen in Verbindung gebracht, bei denen BMP-Gradienten Zellschicksal, Differenzierung und die Organisation der extrazellulären Matrix beeinflussen. CHRD ist daher relevant für Studien zur Dynamik von Morphogensignalen, zur Linienfestlegung und zur kontextabhängigen Modulation des BMP-Signalwegs in humanen Zellen.

chordin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHRD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

chordin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHRD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHRD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen chordin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHRD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von chordin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des chordin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHRD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.