ChM-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403523-ACT

CNMD kodiert Chondromodulin-1 (ChM-1), ein sezerniertes, mit der extrazellulären Matrix assoziiertes Protein, das in avaskulärem Knorpel angereichert ist und an der Aufrechterhaltung des anti-angiogenen Mikromilieus in sich entwickelnden und ausgereiften Bindegeweben beteiligt ist. ChM-1 wirkt an der Regulation des Verhaltens von Endothelzellen, der Knorpelhomöostase und dem Umbau der extrazellulären Matrix mit und ist damit mit Signalwegen verknüpft, die die Gewebevaskularisierung und die chondrogene Differenzierung koordinieren. Eine veränderte CNMD-Expression wurde im Zusammenhang mit Knorpeldegeneration und abnormer Neovaskularisation untersucht, wobei Verschiebungen in der Matrixsignalgebung Entzündungs- und Hypoxieantworten beeinflussen können. Daher wird CNMD in der muskuloskelettalen Biologie, der Gefäßbiologie und der Forschung zum Tumormikromilieu breit untersucht – als Modulator des Crosstalks zwischen Stroma und Gefäßen.

ChM-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CNMD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ChM-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CNMD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CNMD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ChM-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CNMD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ChM-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ChM-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CNMD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.