Plasmide CRISPR d'Activation (h) CFTR: sc-400653-ACT

CFTR code le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique, un canal anionique régulé par l’AMPc/PKA qui transporte le chlorure et le bicarbonate à travers les membranes épithéliales afin de contrôler l’hydratation de la surface des voies aériennes, les propriétés du mucus et le pH luminal. L’activité de CFTR s’intègre à des réseaux de transport ionique impliquant ENaC, les échangeurs SLC26 et la machinerie de trafic membranaire pour coordonner la sécrétion de fluides épithéliaux et la clairance mucociliaire. Une expression ou une fonction de CFTR dérégulée perturbe l’homéostasie épithéliale et la défense innée, contribuant à la fibrose kystique et à des troubles apparentés touchant les poumons, le pancréas, l’intestin et les tissus reproducteurs. CFTR est donc largement étudié en signalisation épithéliale, protéostasie et trafic membranaire, ainsi que dans des modèles d’organoïdes ou d’épithélium des voies aériennes dédiés au transport ionique.

CFTR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CFTR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CFTR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CFTR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CFTR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CFTR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CFTR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CFTR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CFTR dans les cellules tumorales présentant une expression de CFTR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.