Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCK-BR: sc-401867-ACT

Le gène humain **CCKBR** code le récepteur de la cholécystokinine B (CCK‑BR), un GPCR de classe A activé par les peptides gastrine et cholécystokinine, qui se couple principalement à Gq/11 pour stimuler la phospholipase C, la signalisation IP3/DAG, les flux intracellulaires de Ca2+ et des programmes transcriptionnels dépendants de la PKC. Les effets en aval comprennent la modulation de la signalisation MAPK/ERK, de la dynamique du cytosquelette, ainsi que des réponses sécrétoires et prolifératives dans des contextes gastro-intestinaux et neuronaux. L’activité de CCKBR intègre des signaux neuroendocriniens à l’homéostasie épithéliale et à l’excitabilité, et une dérégulation de la signalisation ou de l’expression du récepteur a été étudiée en lien avec des signaux de croissance aberrants et un remodelage associé à l’inflammation. En tant que récepteur membranaire doté d’une pharmacologie ligand–récepteur bien définie, CCK‑BR est également utilisé pour étudier la désensibilisation des GPCR, leur trafic intracellulaire et le biais des voies de seconds messagers.

CCK-BR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCKBR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCK-BR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCKBR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCKBR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCK-BR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCKBR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCK-BR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCK-BR dans les cellules tumorales présentant une expression de CCKBR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.