Plasmide CRISPR d'Activation (h) CAF-1 p150: sc-402472-ACT

CHAF1A code pour CAF-1 p150, la plus grande sous-unité du complexe CAF-1 (chromatin assembly factor-1), qui dépose les histones H3–H4 sur l’ADN nouvellement synthétisé lors de l’assemblage des nucléosomes couplé à la réplication. En coordonnant la réplication de l’ADN avec la restauration de la chromatine, CAF-1 p150 soutient la progression de la phase S, la stabilité des fourches de réplication et le maintien des états épigénétiques, et contribue à l’intégrité du génome via des interactions avec PCNA et des facteurs de réparation de l’ADN. La perturbation de la fonction de CAF-1 est associée au stress réplicatif, à une organisation altérée de l’hétérochromatine et à des programmes transcriptionnels aberrants, des processus souvent étudiés dans le contexte de la biologie des maladies prolifératives. L’activité de CHAF1A est donc pertinente pour les voies impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN, la dynamique de la chromatine et le contrôle du cycle cellulaire.

CAF-1 p150 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHAF1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CAF-1 p150 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHAF1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHAF1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CAF-1 p150. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHAF1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CAF-1 p150 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CAF-1 p150 dans les cellules tumorales présentant une expression de CHAF1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.