BRWD3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415190-ACT

Das humane BRWD3 kodiert ein chromatinassoziiertes Protein mit Bromodomänen und WD-Repeats, das an der epigenetischen Regulation der Transkription beteiligt ist, indem es die Erkennung von acetylisiertem Lysin mit Chromatin-Remodelling und DNA-templatierten Prozessen koppelt. Über seine Bromodomänen und die als Gerüst dienenden WD-Repeats wird BRWD3 mit der Steuerung von Genexpressionsprogrammen in Verbindung gebracht, die Zellproliferation, Differenzierung und Genomstabilität beeinflussen. Genetische und funktionelle Studien haben eine Fehlregulation von BRWD3 mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen, einschließlich X-chromosomal verknüpfter intellektueller Beeinträchtigung, sowie mit umfassenderen transkriptionellen Störungen in Zusammenhang gebracht, die für die Krebsbiologie relevant sind. BRWD3 dient daher als nützlicher Knotenpunkt, um die Kontrolle chromatinabhängiger Signalwege und Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in humanen Zellen zu untersuchen.

BRWD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BRWD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BRWD3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BRWD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BRWD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BRWD3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BRWD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BRWD3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BRWD3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BRWD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.