BCKDE1A Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-417950-LAC

BCKDHA codifica la subunità E1α del complesso mitocondriale della deidrogenasi degli α-chetoacidi a catena ramificata (BCKDH), un nodo enzimatico chiave nel catabolismo ossidativo degli amminoacidi a catena ramificata leucina, isoleucina e valina. All’interno della matrice mitocondriale, BCKDH collega il turnover degli amminoacidi al metabolismo centrale del carbonio generando derivati acil-CoA che alimentano le vie a valle di produzione di energia e sostengono l’omeostasi metabolica. La funzione di BCKDHA si integra con processi di decarbossilazione ossidativa dipendenti da cofattori e con il controllo di qualità mitocondriale, rendendolo un utile punto di ingresso per studi sul sensing dei nutrienti e sul metabolismo mitocondriale. L’alterazione o la disregolazione di BCKDHA è associata a un metabolismo compromesso degli amminoacidi a catena ramificata ed è rilevante per errori congeniti del metabolismo come la malattia delle urine a sciroppo d’acero.

Le particelle di attivazione lentivirale BCKDE1A (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di BCKDHA in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale BCKDE1A (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione BCKDHA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di BCKDE1A. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo BCKDHA e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.