ATP7A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402387-ACT

ATP7A codifica uma ATPase do tipo P transportadora de cobre que regula a distribuição intracelular de cobre ao exportar cobre do citosol e direcioná-lo para a via secretora, onde é incorporado (metalação) às cuproenzimas. Ao controlar o efluxo e o tráfego de cobre, a ATP7A sustenta a homeostase redox, as respostas mitocondriais e ao estresse oxidativo, e a maturação de enzimas na rede de Golgi. A atividade desregulada de ATP7A desequilibra os níveis de cobre e afeta processos como a formação de tecido conjuntivo e a sinalização do neurodesenvolvimento, devido ao comprometimento da função de cuproenzimas. Consequentemente, ATP7A é amplamente estudada em modelos de distúrbios do metabolismo do cobre e de vias de estresse celular ligadas à atividade enzimática dependente de cobre.

ATP7A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP7A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATP7A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP7A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP7A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATP7A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP7A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATP7A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATP7A em células tumorais com expressão de ATP7A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.