Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP11B: sc-411692-ACT

ATP11B code une flippase de phospholipides de type P4‑ATPase qui contribue au maintien de l’asymétrie lipidique de la membrane plasmique et des endomembranes en transloquant, de manière dépendante de l’ATP, des aminophospholipides à travers les bicouches. En régulant la courbure membranaire et la composition des feuillets, ATP11B participe au bourgeonnement des vésicules, au recyclage endocytique et aux processus de trafic associés à l’appareil de Golgi, qui façonnent le tri des protéines et la polarité cellulaire. Des altérations du transport des phospholipides et de la dynamique membranaire impliquant ATP11B ont été associées dans la littérature à des modifications des phénotypes de transport des médicaments et des réponses au stress dans des modèles de cellules tumorales, ce qui soutient l’étude des mécanismes de chimiorésistance et du trafic intracellulaire. Son activité recoupe également des voies contrôlant l’homéostasie membranaire, la signalisation de l’apoptose liée au « scrambling » des lipides et la fonction des organites.

ATP11B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP11B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP11B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP11B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP11B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP11B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP11B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP11B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP11B dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP11B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.