Atg16 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-429488-ACT

Das murine Atg16l1-Gen kodiert Atg16, eine zentrale Komponente des ATG12–ATG5–ATG16L1-Komplexes, der die Biogenese von Autophagosomen über die LC3-Lipidierung und die Expansion des Phagophors steuert. Dieses Protein verknüpft vorgelagerte Nährstoff- und Stresssignale mit selektiver und nichtselektiver Autophagie und prägt dadurch die mitochondriale Qualitätskontrolle, antimikrobielle Antworten und die Ausgänge inflammatorischer Signalwege. Eine veränderte ATG16L1-Funktion wird mit der Biologie der intestinalen Barriere und der Regulation der angeborenen Immunität in Verbindung gebracht und ist damit relevant für Studien zu Wirt–Mikroben-Interaktionen, inflammatorischen Phänotypen und zellintrinsischer Stressadaptation. In experimentellen Systemen kann eine Störung von Atg16l1 den autophagischen Flux und nachgeschaltete Zytokinwege modulieren und so die mechanistische Analyse autophagieabhängiger Homöostase unterstützen.

Atg16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atg16l1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg16 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atg16l1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atg16l1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg16-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atg16l1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg16-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg16-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atg16l1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.