Atg14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402883-ACT

Das humane Gen **ATG14** kodiert **Atg14**, eine zentrale Komponente des Klasse-III-Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3KC3)-Komplexes I, der die Bildung von Phosphatidylinositol-3-phosphat an entstehenden autophagosomalen Membranen fördert. Atg14 trägt zur Festlegung der Autophagie-Initiation bei, indem es den Beclin-1–VPS34-Komplex zum endoplasmatischen Retikulum und zu Phagophor-Assemblierungsstellen dirigiert und so die Nukleation und Reifung von Autophagosomen unterstützt. Durch die Steuerung des autophagischen Flusses und selektiver Abbauwege beeinflusst ATG14 die Proteostase, die Qualitätskontrolle von Organellen und zelluläre Antworten auf Nährstoffstress. Eine fehlregulierte Autophagie unter Beteiligung von ATG14 wurde mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die für Krebsbiologie, Neurodegeneration und entzündliche Signalübertragung relevant sind, was ATG14 zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung entsprechender Signalwege macht.

Atg14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATG14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Atg14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATG14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATG14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Atg14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATG14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Atg14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Atg14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATG14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.