Plasmide CRISPR d'Activation (h) Asparagine synthetase: sc-402240-ACT

ASNS humain code l’asparagine synthétase, une enzyme cytosolique qui catalyse la conversion, dépendante de l’ATP, de l’aspartate et de la glutamine en asparagine et en glutamate, reliant l’homéostasie des acides aminés au métabolisme de l’azote. L’expression d’ASNS est régulée par des voies de signalisation liées aux nutriments et au stress, notamment la réponse intégrée au stress et la réponse aux acides aminés, et peut influencer la capacité de synthèse protéique en situation de limitation métabolique. Une activité d’ASNS altérée a été associée à l’adaptation cellulaire à la privation de nutriments et à des modifications de l’aptitude proliférative. Des variants héréditaires perte de fonction d’ASNS sont liés au déficit en ASNS, un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une altération du développement cérébral, soulignant l’importance de ce gène pour l’équilibre des acides aminés à l’échelle de l’organisme.

Asparagine synthetase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ASNS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Asparagine synthetase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ASNS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ASNS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Asparagine synthetase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ASNS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Asparagine synthetase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Asparagine synthetase dans les cellules tumorales présentant une expression de ASNS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.