Asparagine synthetase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402240-ACT

L’ASNS umano codifica l’asparagina sintetasi, un enzima citosolico che catalizza la conversione, dipendente da ATP, di aspartato e glutammina in asparagina e glutammato, collegando l’omeostasi degli amminoacidi al metabolismo dell’azoto. L’espressione di ASNS è regolata da segnali nutrizionali e di stress, inclusi la risposta integrata allo stress e le vie di risposta agli amminoacidi, e può influenzare la capacità di sintesi proteica in condizioni di limitazione metabolica. Un’attività alterata di ASNS è stata associata all’adattamento cellulare alla carenza di nutrienti e a cambiamenti nella fitness proliferativa. Varianti ereditarie loss-of-function in ASNS sono collegate alla carenza di ASNS, un disturbo del neurosviluppo caratterizzato da uno sviluppo cerebrale compromesso, evidenziando l’importanza del gene per l’equilibrio amminoacidico dell’organismo.

Asparagine synthetase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ASNS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Asparagine synthetase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ASNS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ASNS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Asparagine synthetase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ASNS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Asparagine synthetase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Asparagine synthetase nelle cellule tumorali con espressione di ASNS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.