Plásmido CRISPR de Activación (h) ASF1A: sc-404071-ACT

ASF1A codifica la función anti-silenciamiento 1A, una chaperona conservada de histonas H3–H4 que coordina el ensamblaje y desensamblaje de nucleosomas durante la replicación del ADN, la transcripción y la reparación del daño en el ADN. Al asociarse con reguladores de la cromatina como CAF-1 y HIRA, ASF1A favorece el reensamblaje de la cromatina acoplado a la replicación, la dinámica del suministro de histonas y el mantenimiento de estados epigenéticos a lo largo del ciclo celular. La actividad alterada de ASF1A puede perturbar los programas de estabilidad del genoma y la accesibilidad de la cromatina, vinculando este factor con la proliferación desregulada y las respuestas al estrés observadas en el cáncer y otras enfermedades con defectos en el remodelado de la cromatina. Como nodo central de la homeostasis de la cromatina, ASF1A se estudia con frecuencia en vías que gobiernan el estrés de replicación, la señalización de puntos de control y la reprogramación transcripcional.

ASF1A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ASF1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ASF1A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ASF1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ASF1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ASF1A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ASF1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ASF1A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ASF1A en células tumorales con expresión de ASF1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.