Aminopeptidase A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403989-ACT

ENPEP kodiert die Aminopeptidase A (APA), eine zinkabhängige membranständige Aminopeptidase, die bevorzugt N-terminale saure Aminosäurereste von bioaktiven Peptiden abspaltet. Im Renin‑Angiotensin‑System trägt APA zur Verarbeitung von Angiotensin II bei und beeinflusst nachgeschaltete Signalwege, die mit dem Gefäßtonus und der neuroendokrinen Regulation verknüpft sind; zusätzlich spielt sie eine Rolle im Peptidstoffwechsel an der Zelloberfläche. Die ENPEP-Expression ist vor allem in der Niere und anderen epithelialen Kompartimenten ausgeprägt, wo sie mit proteolytischer Prozessierung, Membrantransport und der lokalen Homöostase von Peptidhormonen zusammenwirkt. Eine Fehlregulation der APA-Aktivität oder der ENPEP-Expression wurde mit veränderter Blutdruckregulation und renaler Pathophysiologie in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien in kardiometabolischen und nierenrelevanten Zellmodellen motiviert.

Aminopeptidase A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENPEP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Aminopeptidase A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENPEP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENPEP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Aminopeptidase A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENPEP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Aminopeptidase A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Aminopeptidase A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENPEP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.