Plásmido CRISPR de Activación (h) ALKBH8: sc-407123-ACT

ALKBH8 codifica una oxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato/Fe(II) implicada en la modificación del ARN, en particular en la maduración de la uridina “wobble” (U34) en ciertos ARNt mediante pasos de metilación y posterior hidroxilación. Al modular la eficiencia de decodificación del ARNt y la fidelidad de la traducción, ALKBH8 vincula la regulación epitranscriptómica del ARN con el mantenimiento del proteoma y las respuestas celulares al estrés. La alteración de la actividad de ALKBH8 puede modificar programas de traducción con sesgo de codones y se ha asociado con fenotipos de proliferación desregulada e inestabilidad genómica en sistemas modelo. Estas características hacen que ALKBH8 sea relevante para estudios del metabolismo del ARN, la adaptación al estrés oxidativo y la reprogramación de la traducción asociada a enfermedades.

ALKBH8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ALKBH8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ALKBH8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ALKBH8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ALKBH8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ALKBH8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ALKBH8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ALKBH8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ALKBH8 en células tumorales con expresión de ALKBH8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.