AKR1C14 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430591-ACT

Akr1c14 kodiert AKR1C14, eine murine Aldo-Keto-Reduktase, die die NADPH-abhängige Reduktion von carbonylhaltigen Substraten katalysiert, darunter endogene Steroide und Lipidaldehyde. Durch die Modulation der lokalen Verfügbarkeit von Steroidhormonen und die Entgiftung reaktiver Carbonylspezies trägt AKR1C14 zur Redox-Homöostase und zur metabolischen Signalgebung in Geweben wie Leber und Fortpflanzungsorganen bei. Diese enzymatische Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die mit Xenobiotika-Metabolismus, Antworten auf oxidativen Stress und der Regulation der nukleären Rezeptor-Signalgebung verbunden sind. Veränderte Aldo-Keto-Reduktase-Aktivität wird häufig im Kontext von Stoffwechselstörungen, Entzündungen und hormonabhängiger Physiologie untersucht, wodurch Akr1c14 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen in Mausmodellen darstellt.

AKR1C14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Akr1c14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AKR1C14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Akr1c14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Akr1c14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AKR1C14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Akr1c14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AKR1C14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AKR1C14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Akr1c14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.