Plasmide CRISPR d'Activation (h) AKAP 12: sc-406008-ACT

AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12 ; gravin) est une protéine d’échafaudage qui organise spatialement la signalisation de la PKA et de la PKC à la membrane plasmique et au niveau du cytosquelette, en coordonnant la désensibilisation des récepteurs, le remodelage du cytosquelette et le contrôle du cycle cellulaire. En ancrant des kinases et des phosphatases à proximité des RCPG (GPCR) et des intégrines, AKAP12 influence des voies qui régissent la dynamique des adhésions focales, la migration cellulaire et la fonction de barrière, avec des effets en aval sur la signalisation MAPK et dépendante de l’AMPc. Des altérations de l’expression d’AKAP12 et de sa régulation épigénétique ont été associées à des modifications des programmes d’adhésion et de motilité cellulaires pertinents pour la biologie des cancers, les dysfonctions vasculaires et les microenvironnements inflammatoires. Ces propriétés font d’AKAP12 un nœud utile pour étudier la compartimentation des signaux et les réponses transcriptionnelles dépendantes du contexte dans les cellules humaines.

AKAP 12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AKAP12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AKAP 12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AKAP12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AKAP12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AKAP 12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AKAP12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AKAP 12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AKAP 12 dans les cellules tumorales présentant une expression de AKAP12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.