Plasmide CRISPR d'Activation (h) AIP4: sc-401677-ACT

L’ITCH humain code la ligase E3 d’ubiquitine de type HECT AIP4, un régulateur majeur du renouvellement protéique qui contrôle la durée des signaux en catalysant l’ubiquitination ainsi que le ciblage protéasomal ou lysosomal de substrats spécifiques. AIP4 module de nombreuses voies, notamment la signalisation du récepteur des lymphocytes T, les voies NF-κB et MAPK, ainsi que la dynamique de la voie TGF-β/SMAD, influençant ainsi l’homéostasie immunitaire, l’inflammation et les réponses au stress cellulaire. En régulant la stabilité et le trafic des récepteurs et des adaptateurs de signalisation, ITCH affecte l’apoptose, la différenciation et des programmes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse. Une activité ou une expression dérégulée d’ITCH a été associée à des phénotypes de dysrégulation immunitaire et à des réseaux de signalisation oncogéniques altérés, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques du contrôle des voies dépendant de l’ubiquitine.

AIP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ITCH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AIP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ITCH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ITCH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AIP4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ITCH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AIP4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AIP4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ITCH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.