ADAMTS-9 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430369-ACT

Adamts9 kodiert ADAMTS-9, eine sekretierte Metalloprotease aus der ADAMTS-Familie, die die extrazelluläre Matrix durch die Prozessierung von Proteoglykanen und verwandten Substraten umgestaltet. In Mausgeweben trägt ADAMTS-9 zum Umsatz der perizellulären Matrix, zur Zellmigration und zu morphogenetischen Programmen bei, die die Organentwicklung und die Gewebehomöostase prägen. Seine Aktivität greift in Signalwege ein, die die Matrixorganisation, die Knorpel- und Skelettbiologie sowie stromale Signalgebung regulieren und damit entzündliche und fibrotische Mikroumgebungen beeinflussen. Eine veränderte Adamts9-Expression oder -Funktion wurde mit Entwicklungsanomalien und matrixgetriebenen Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung extrazellulärer Proteasenetzwerke macht.

ADAMTS-9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Adamts9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAMTS-9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Adamts9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Adamts9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAMTS-9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Adamts9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAMTS-9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAMTS-9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Adamts9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.