α-SNAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403996-ACT

NAPA kodiert das menschliche α‑SNAP, ein lösliches NSF‑Anheftungsprotein, das an SNARE‑Komplexe bindet und mit NSF zusammenwirkt, um deren ATP‑abhängige Dissoziation anzutreiben und so wiederholte Zyklen des Vesikel-Andockens und der Membranfusion zu ermöglichen. Über diese chaperonähnliche Funktion unterstützt α‑SNAP sowohl die konstitutive als auch die regulierte Exozytose, die Endozytose sowie den Transport vom Golgi zum ER und beeinflusst damit Sekretion, Rezeptor‑Recycling und die Homöostase von Organellen. Störungen des NAPA‑abhängigen SNARE‑Zyklus können Proteostase und Membrandynamik beeinträchtigen – Prozesse, die mit synaptischer Funktion und Stressantworten verknüpft sind. Fehlregulierter Vesikeltransport und ein gestörter Umsatz von SNARE‑Komplexen werden mit Mechanismen neurodegenerativer und neuroentwicklungsbedingter Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, wodurch α‑SNAP ein hilfreicher Knotenpunkt für pfadorientierte Untersuchungen des intrazellulären Transports ist.

α-SNAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NAPA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

α-SNAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NAPA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NAPA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen α-SNAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NAPA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von α-SNAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des α-SNAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NAPA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.