CRISPR Systems

CRISPR/Cas9 Plasmids

CRISPR/Cas9 Plasmid product details:

• 20 µg, 20 transfections
• CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids는 Cas9 nuclease 와 특정된 타깃의 고효율 knockout을 위해 디자인된 20 nt guide RNA (gRNA)을 포함하고있습니다.
• gRNA sequences는 GeCKO (v2) library에서 찾을수 있으며 직접 Cas9 프로틴을 유도하여 유전자 DNA의(11) 특정된 위치에서 double strand break (DSB)를 완성할수있습니다.
• CRISPR/Cas9 KO Plasmids 는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (m) for mouse
• Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for CRISPR/Cas9 Plasmids:

• control antibody
• Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
• Plasmid Transfection Medium, sc-108062
• Control CRISPR/Cas9 Plasmid, sc-418922

HDR Plasmid

HDR Plasmid description:

• HDR plasmids provide a specific DNA repair template for a DSB, and are only used when co-transfected with CRISPR/Cas9 KO Plasmids.
• CRISPR/ Cas9 KO Plasmid와 co-transfect할시 HDR Plasmid는 Puromycin resistance gene을 통합하여 Cas9-induced DNA cleavage가 완성된 cells을 선정합니다.

HDR Plasmid product details:

• 20 µg, 20 transfections
• 특정타깃의 HDR Plasmids는 같은 species, 같은 타깃유전자의 CRISPR/Cas9 KO Plasmid와 co-transfection하는것을 권장합니다
• HDR Plasmid 는2-3개의 plasmids를 함유하고 있으며, plasmid마다 하나의 homology-directed DNA repair (HDR) template를 함유하고있으며, 이 위치는 corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids로 진행된 컷트 위치에 해당됩니다
• 매 HDR template은 두개의 800 bp homology arms이 디자인되여있어 genomic DNA 주변의 Cas9-induced double strand DNA break site와 결합합니다
• 매 HDR Plasmid 에는 puromycin resistance gene이 있어 stable knockout (KO) cells을 얻을수있습니다
• 매 puromycin resistance gene의 양측에는 두개의 LoxP sites 가 디자인되여있으며 Cre vector의 추가가공이 가능합니다
• 매 HDR Plasmid 마다 RFP 를 포함하고있어 transfection을 시각적으로 확인할수있습니다
• Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for HDR Plasmids:

• Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
• Plasmid Transfection Medium, sc-108062
• Puromycin dihydrochloride, sc-108071
• L-755,507, sc-204045

Allelic Expression

배수체 세포는 각 염색체마다 두개의 상동한 복제로서 각각의 유전자를 두개의 복제로 지니고 있습니다. 같은 유전자를 지닌 복제는 똑같을 필요가 없으며 대립형질로 알려지고 있습니다. 또한 같은유전자의 대립형질의 특정된 염색체위치에 위치하고있습니다. 한개체내에서 하나의 형질이 흔히 발현하며 우성으로 야생형을 표현하게됩니다. 변이는 새로운 형질을 만들고 각각의 새로은 형질은 표현형을 변화시키게 됩니다.

이배체세포는 대다수 유전자의 두개의 대립형질을 갖고 있기때문에 각각의 타깃유전자 knockout을 함으로서 동형넉아웃(homozygous knockout) 세포집단을 만들려면 추가적으로 transfection과 selection필요할수 있습니다. CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid만 사용할시 NHEJ복구가 발생하며 타깃유전자의 삽입과 삭제 mutation을 초래할수 있습니다. CRISPR/Cas9 Plasmid transfection후 타깃유전자는 두 대립형질에서 knockout (bi-allelic knockout) 이발생할수도 있으나 어떤 세포에서는 하나의 대립형질에서 knockout (mono-allelic knockout)이 발생합니다. CRISPR/Cas9으로 transfection을 한 세포집단에는 bi-allelic 과 mono-allelic knockout 세포가 포함됩니다.

CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid로 transfection한후 세포집단중 bi-allelic 이나 mono-allelic knockout이 발생하였는지를 웨스턴블롯으로 확인할수 있습니다. 세포의 단일세포집단을 분리하면 mono-allelic 이나 bi-allelic인 세포줄기를 배양할수 있습니다. 이 세포집단을 가득채우게 배양한후 웨스턴블롯은 어떤 집단이 타깃유전자가 bi-allelic 이나 mono-allelic knockdown 되였는지를 분석할수 있습니다. bi-allelic knockout 된 세포집단은 타깃유전자의 100% knockdown을 나타내며 mono-allelic knockdown된 세포집단은 타깃유전자의 50% knockdown을 나타내게 됩니다.

CRISPR/Cas9 Plasmid와 Homology Directed Repair (HDR) Plasmid를 이용하여 co-transfection에 성공하면 타깃 유전자는 파괴되고 homologous directed repair (HDR)가 일어나게 됩니다. co-transfection후 puromycin resistance 유전자가 삽입된 세포를 선발할수 있습니다. 이렇게 선발된 세포에는 mono-allelic 와 bi-allelic 세포 모두 있습니다. 이때 웨스턴블롯은 어떤 세포집단이 타깃유전자의 bi-allelic knockout인지를 확인하는데 도움이 됩니다.

Cre Vector

Cre Vector description:

• Cre Vector는 Cre recombinase을 발현하는데 이는 LoxP사이트 사이의 특정위치 DNA recombination를 촉진하는 bacteriophage p1 효소입니다
• When the CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid is co-transfected with the HDR Plasmid, cells containing the edited DNA can be isolated using the selection marker inserted during homology-directed repair
• selection후, Cre Vector으로 cell을 transfect시켜 homology-directed repair을 통해 타깃유전물질 (puromycin등)을 절제합니다

Cre Vector product details:

• 20 µg, 20 transfections
• Recommended for DNA repair of selected cells successfully edited by CRISPR/Cas9 KO Plasmid and HDR Plasmid
• Cre Vector 는 CMV promoter로 Cre recombinase를 expression합니다
• Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.
• Cre Vector, sc-418923

Support Products for Cre Vector:

• Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
• Plasmid Transfection Medium, sc-108062

Double Nickase Plasmids

Double Nickase Plasmid product details:

• 20 µg, 20 transfections
• Double Nickase Plasmids 는 한쌍의 plasmid를 포함하고 있으며 매개의 plasmid는 D10A 변이된 Cas9뉴클레아제와 특정된 타깃의 고효율 knockout을 위해 디자인된 20 nt guide RNA (gRNA)을 포함하고있으며 이는 CRISPR/Cas9 KO 제품에 비해 특이성이 뛰여납니다.
• 한쌍의 gRNA는 약 20bp가량 떨어져 있으며 이는 게놈DNA의 Cas9-mediated double nicking을 발생하여 DSB를 모방합니다.
• 한쌍의 plasmid 중 하나는 selection에 필요한 puromycin-resistance gene을, 다른하나는 형질주입효율을 확인하는 GFP marker를 보유하고있습니다.
• Double Nickase Plasmids는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/Cas9 Double Nickase Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/Cas9 Double Nickase Plasmids (m) for mouse
• Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for Double Nickase Plasmids:

• control antibody
• Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
• Plasmid Transfection Medium, sc-108062
• Control Double Nickase Plasmid, sc-437281
• Puromycin dihydrochloride, sc-108071

Activation Plasmids

CRISPR/dCas9 Activation Plasmid product details:

• 20 µg, 20 transfections
• CRISPR/dCas9 Activation Plasmids are a synergistic activation mediator (SAM) transcription activation system designed to specifically upregulate gene expression
• CRISPR/dCas9 Activation Plasmids consist of the following three plasmids at a 1:1:1 mass ratio: a plasmid encoding the deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A) fused to the transactivation domain VP64; a plasmid encoding the MS2-p65-HSF1 fusion protein; and a plasmid encoding a target-specific 20 nt guide RNA
• gRNA sequences are derived from the CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) pooled human library and direct the SAM complex to bind to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of the transcriptional start site of the target gene
• The SAM system provides robust recruitment of transcription factors for highly efficient activation of the target gene
• CRISPR/dCas9 Activation Plasmids 는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmids (m) for mouse
• Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for CRISPR Activation Plasmids:

• control antibody
• Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
• Plasmid Transfection Medium, sc-108062
• Control CRISPR/dCas9 Activation Plasmid, sc-437275
• Blasticidin S HCl solution, sc-495389
• Hygromycin B, sc-29067
• Puromycin dihydrochloride, sc-108071

Lentiviral Activation Particles

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

• Lentiviral Activation Particles encode a synergistic activation mediator (SAM) transcription activation system designed to specifically and efficiently upregulate gene expression via lentiviral transduction of cells (13)
• The SAM complex binds to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of the transcriptional start site and provides robust recruitment of transcription factors for highly efficient gene activation
• Lentiviral Activation Particles are supplied frozen in 200 µl of Dulbecco's Modified Eagle Medium with 25 mM HEPES pH 7.3, containing the critical elements in the three CRISPR/dCas9 Activation plasmids, that are required for targeted gene upregulation:
  1. Deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A) fused to the transactivation domain VP64, and blasticidin resistance genes
  2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes
  3. Target-specific 20 nt. guide RNA, and a Puromycin resistance gene
• 형질주입이 어려운 세포에 권장합니다
• CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles (h) for human or p53 CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles (m) for mouse

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

• Control Lentiviral Activation Particles, sc-437282
• Polybrene®, sc-134220
• Blasticidin S HCl solution, sc-495389
• Hygromycin B, sc-29067
• Puromycin dihydrochloride, sc-108071
• control antibody