Plásmido CRISPR de Activación (h) Visual Arrestin: sc-402997-ACT

SAG codifica la arrestina visual (arrestina-1), una proteína reguladora específica de los fotorreceptores que finaliza la señalización de la rodopsina al unirse a la rodopsina fosforilada y activada por la luz, y al modular la fototransducción mediada por transducina aguas abajo. Este paso de desensibilización es esencial para la cinética de recuperación, la fidelidad de la señal y la protección de las células bastón frente a una activación excesiva de la vía de los GPCR. La arrestina visual también contribuye al tráfico del receptor y al equilibrio de señalización dentro del segmento externo, integrándose con los ciclos de fosforilación de la rodopsina impulsados por GRK1. La desregulación o las variantes patogénicas en SAG se asocian con disfunción retiniana hereditaria, lo que la convierte en un objetivo clave para estudios mecanísticos sobre el estrés de los fotorreceptores, las vías de degeneración y la transducción de la señal visual.

Visual Arrestin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SAG sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Visual Arrestin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SAG en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SAG, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Visual Arrestin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SAG y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Visual Arrestin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Visual Arrestin en células tumorales con expresión de SAG silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.