VAP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401777-ACT

AOC3 kodiert das vaskuläre Adhäsionsprotein-1 (VAP-1), ein Oberflächen-Glykoprotein von Endothel- und glatten Muskelzellen, das sowohl als Adhäsionsmolekül als auch als kupferabhängige Aminoxidase (SSAO) fungiert. Durch die Katalyse der oxidativen Desaminierung primärer Amine erzeugt VAP-1 Aldehyde, Wasserstoffperoxid und Ammoniak und verknüpft so den Leukozytentransport mit Redox-Signalgebung und vaskulären Entzündungsreaktionen. VAP-1 trägt zum Rollen, zur Adhäsion und zur Transmigration von Leukozyten bei und greift in Signalwege ein, die die Endothelaktivierung, den Umbau der extrazellulären Matrix und oxidativen Stress steuern. Eine fehlregulierte AOC3/VAP-1-Aktivität wurde mit chronischen Entzündungszuständen und vaskulärer Pathologie in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischer Knotenpunkt in Forschungsmodellen zu Immunmetabolismus und entzündungsfokussierter Forschung unterstützt.

VAP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AOC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VAP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AOC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AOC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VAP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AOC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VAP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VAP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AOC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.